AG Lars Voll

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Molekulare Wechselwirkungen

Der pflanzliche Stoffwechsel unterliegt einer komplexen Kontrolle durch Entwicklungsprozesse und Umweltbedingungen, die die Interaktion zwischen (photo)autotrophen source-Blättern auf der einen und sink-Organen wie Blüten, wachsenden Blättern, Wurzeln und Speicherorganen auf der anderen Seite moduliert. Die Kommunikation zwischen source- und sink-Organen ist eine Grundvoraussetzung für pflanzliches Wachstum und Entwicklung und stellt daher auch eine Schlüsselrolle für den Ernteertrag dar. Das source-sink-Gefüge wird jedoch sowohl bei biotischem als auch bei abitotischem Stress empfindlich gestört.

Identifizierung metabolischer Kompatibilitätsfaktoren bei der Interaktion von Pflanzen mit phytopathogenen Pilzen

Phytopathogene Pilze haben im Laufe der Koevolution mit ihren Wirten hochspezialisierte Strategien entwickelt, das source-sink-Gefüge ihrer Wirtspflanzen zu verändern und die Abwehrantwort des Wirts zu unterdrücken. Biotrophe und hemibiotrophe Pilze sind zumindest während eines Teils ihres Entwicklungszyklus auf lebende Wirtszellen angewiesen und manipulieren den Wirtsstoffwechsel an der Infektionsstelle derart, dass Kohlenstoff- und Stickstoff-Assimilation und –verteilung sich ihren Bedürfnissen gemäss verschieben. Das Verständnis, wie pilzliche Pathogene es vermögen den Wirtsstoffwechsel umzuprogrammieren sollte nicht nur die Züchtung pathogen-resistenterer Pflanzen ermöglichen, sondern auch helfen den Ernteertrag von Nutzpflanzen zu steigern: sobald geklärt ist, welcher molekularen Mechanismen und welcher Zielproteine sich Pathogene für die Umsteuerung der Assimilatverteilung bedienen, könnte dieses Wissen in der Pflanzenzüchtung bei der Selektion neuer Sorten eingesetzt werden, die Assimilate auf dieselbe Weise in Ertrag umsteuern. Zur Zeit ist die Kenntnis über pilzliche Effektorproteine, deren molekulare Funktion und deren Ziele im Wirt noch begrenzt, genauso wie das Wissen über die Bedeutung von Stoffwechselvorgängen für die Kompatibilität bei der Interaktion von Pflanzen mit phytopathogenen Pilzen.

Das Ziel der Arbeitsgruppe Metabolic Interactions ist zu verstehen, wie Stoffwechselprozesse die Pathogenität des Pilzes bzw. die Suszeptibilität der Wirtspflanze beeinflussen können und darüberhinaus die dafür verantwortlichen molekularen und Stoffwechsel-Prozesse in Pathogen und Wirt zu identifizieren. Durch die Untersuchung von Mutanten und transgenen Organismen beider Interaktionspartner studieren wir insbesondere die Bedeutung bestimmter Schritte im zentralen, primären Kohlenstoff- und Stickstoff-Stoffwechsel für i) den Penetrationserfolg des Pathogens und ii) die Effektivität der Wirtsantwort. Pflanzenphysiologische Untersuchungen an infizierten Pflanzen auf systemischer Ebene sind dabei wichtiger Bestandteil unserer Strategie.

Abbildung 1.
links:   Blattphänotyp acht Tage nach der Infektion von Maispflanzen mit dem biotrophen phytopathogenen Pilz Ustilago maydis.   Foto von R.J.Horst.
rechts:   Blattphänotyp von Arabidopsis-Pflanzen vier Tage nach der Infektion mit dem hemibiotrophen Pilz Colletotrichum higginsianum (rechte Pflanze) im Vergleich zu einer nicht-infizierten Kontrollpflanze (linke Pflanze). Foto von T. Engelsdorf.

U.a. im Rahmen der DFG-Forschergruppe 666 (FOR666) werden verschiedene Pflanze-Pilz-Interaktionen bearbeitet, die zumeist Getreide betreffen:

(A)   Biotrophe Pilze:

  • Blumeria graminis f.sp. hordei auf Gerste
  • Ustilago maydis auf Mais (Abb. 1 & 3)

(B)   Hemibiotrophe Pilze:

  • Colletotrichum graminicola auf Mais (Abb. 3)
  • Colletotrichum higginsianum auf Arabidopsis thaliana (Abb. 1)

Für die Generierung und Validierung unserer Hypothesen setzen wir verschiedene chlüsseltechnologien ein:

(a)   Transkriptom-Analysen auf Agilent custom microarrays - unterstützt durch die Arbeitsgruppe Transcriptomics.

(b)   Metabolom-Analysen, insbesondere durch

  • Markierungsexperimente und -kinetiken mit den stabilen Isotopen 13C und 15N ,
  • die Analyse von Stoffwechselmustern (metabolic fingerprinting) und
  • gezielte Stoffwechseluntersuchungen (targeted metabolomics),

Dabei werden HPLC, IC, HPLC-MS/MS, IC-MS/MS, GC-MS und photometrische Tests, die z.T. in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Bioanalytik durchgeführt werden.

Um ein umfassendes Bild zu erhalten werden komplementär zu diesen molekularen Techniken physiologische Messungen auf der Ebene intakter Blätter und gesamter Pflanzen eingesetzt, die

(c)   ein kombiniertes IRGA-Imaging-PAM System (s. Abb. 2) für die simultane Messung des photosynthetischen Gaswechsels (IRGA) und der räumlich aufgelösten Analyse von Chlorophyll-Fluoreszenz (PAM) als essentiellen Bestandteil beinhalten.

 

Abbildung 2.   Aufbau des Walz GFS-3000, dem kombinierten Infrarot Gas-Analyse (IRGA)-Chlorophyll-Imaging-System.

Zur Veranschaulichung sind in Abbildung 3 Chlorophyll Fluoreszenz-Analysen von Maisblättern dargestellt, die mit dem biotrophen Pathogen Ustilago maydis (linke Seite) und dem hemibiotrophen Pilz Colletotrichum graminicola (rechte Seite) infiziert sind.

Abbildung 3.   Chlorophyll Fluoreszenz Imaging-Analyse infizierter Maisblätter.
linke Seite:   Chlorophyll Fluoreszenz Imaging-Analyse von Maisblättern, sechs Tage nach der Infektion mit dem biotrophen Pilz U. maydis (rechts) und nicht infizierte Kontrollblätter (links). Die maximale Photosystem II (PSII) Quantenausbeute Fv/Fm (oben), die aktiv regulierte Energieverstahlung qN (Mitte) und nicht-regulierte Energie-Verstrahlung Y(NO) (unten) sind gemäss der Skala des Farbbalkens rechts unten in Falschfarben im Bereich von 0 (schwarz) bis 1 (violett) dargestellt.   Daten von R.J. Horst.
rechte Seite:   Chlorophyll Fluoreszenz Imaging-Analyse eines mit dem hemibiotrophen Pilz C. graminicola infizierten Maisblattes. Die Photosystem II Quanteneffizienz im Licht (ΦPSII - oben) und die maximale Photosystem II Quantenausbeute Fv/Fm (Mitte) sind gemäss des Referenzbalkens unten in der Abbildung als Falschfarbenbilder im Skalenbereich von von 0 (schwarz) bis 1 (violett) dargestellt. Zum Vergleich ist ein Foto desselben Blattsegmentes unten in der Abbildung aufgeführt.   Daten von A.M. Koszucka.

Die Bedeutung einzelner Antioxidantien für die abiotische Stresstoleranz in Blättern

Ein weiteres Arbeitsgebiet der Arbeitsgruppe Metabolic Interactions stellt die Antwort der Pflanze auf abiotischen Stress dar. Um die Rolle bestimmter Antioxidantien wie Ascorbat (Vitamin C), Glutathion oder Tocochromanolen (Vitamin E) untersuchen zu können, setzen wir bei unseren Forschungsarbeiten verschiedene transgene Pflanzen ein, in denen wir den Stoffwechel einzelner Antioxidantien verändert haben.

Tocochromanole sind amphiphile Antioxidantien, die am Ort des photosynthetischen Elektronentransportes, den Thylakoiden, angereichert sind. Im Verlaufe der Lichtreaktion der Photosynthese werden permanent reaktive Sauerstoffspezies (ROS), wie Superoxidanionen (O2-) oder Singulettsauerstoff (1O2) als Nebenprodukte gebildet. Tocochromanole machen ROS unmittelbar am Entstehungsort unschädlich und entlasten so die löslichen Antioxidantien Ascorbat und Glutathion.

Blätter zweikeimblättriger Pflanzen akkumulieren fast ausschliesslich α-Tocopherol, während Samen Vitamin E vorwiegend als γ-Tocopherol einlagern. Wir haben anhand von transgenen Tabakpflanzen, in denen i) Tocopherol um über 98% reduziert ist und solchen, bei denen ii) α-Tocopherol in Blättern durch γ-Tocopherol ausgetauscht wurde, herausgefunden, dass γ-Tocopherol viel effizienter oxidativem Stress in Blättern entgegenwirkt als α-Tocopherol, wie bei dem durch Sorbitol induzierten osmotischen Stress (Abb. 4).

Abbildung 4.   Auswirkung des durch Sorbitol ausgelösten oxidativen Stresses auf Tabakpflanzen in Sterilkultur nach vier Wochen auf den angegebenen Sorbitolkonzentrationen. Im Vergleich zum Wildtyp SNN (mit 95% α-Tocopherol in Blättern) und zu den transgenen HPT:RNAi-Pflanzen (mit 2% Rest- Tocopherol-Gehalt in Blättern) sind die transgenen γ-TMT-Tabakpflanzen (mit 95% γ-Tocopherol statt α-Tocopherol) toleranter gegenüber Sorbitol. In den γ-TMT Tabakpflanzen ist die γ-Tocopherol-Methyltransferase (γ-TMT) durch die Expression eines γ-TMT-spezifischen Haarnadel-RNAi-Konstruktes unterdrückt, während in den transgenen HPT-Tabakpflanzen, die Homogentisat-Phytyltransferase (HPT) mit derselben molekularen Technik post-transkriptionell supprimiert ist.   Daten von P. Hennig und A.R. Abbasi.